酵母雙雜交檢測（Yeast Two-Hybrid Assay）產品專題 

檢測原理：

酵母雙雜交系統（Yeast two-hybrid assay）是用于體內研究蛋白相互作用的一種非常便利的工具，常用的如GAL4為基礎的系統，使用酵母轉錄因子GAL4來檢測轉錄激活后的蛋白相互作用。某些轉錄因子（如GAL4）由兩個可以分開，功能上相互獨立的結構域組成，N端有一個147個氨基酸組成的DNA結合域（DNA binding domain，BD），C端有一個由113個氨基酸組成的轉錄激活域（transcription activation domain，AD）。BD可以和上游激活序列（UAS）結合，而AD能激活UAS下游基因進行轉錄。單獨的BD或AD不能激活基因轉錄，兩者只有通過某種方式結合在一起形成完整的轉錄激活因子的功能【見圖1】。酵母雙雜交系統主要利用酵母GAL4的這個特性通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結合及對報告基因的轉錄激活來研究活細胞內蛋白質的相互作用，對蛋白質之間微弱、瞬間的作用都能通過報告基因敏感的檢測到。

酵母雙雜交系統應用：

1. 對新的與已經蛋白相互作用的鑒定
2. 對預測蛋白相互作用的確認
3. 對蛋白相互作用區域的鑒定

圖1. 雙雜交檢測原理圖。兩個蛋白分別表達，一個（誘餌蛋白bait protein）融合到Gal4 DNA結合域表達，另一個（誘捕蛋白prey protein）融合到Gal4轉錄激活結構域（AD）表達。在Y2HGold酵母菌株中，只有當兩個蛋白之間相互作用并結合到Gal4反應性啟動子上才能活化報告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表達。

酵母雙雜交系統操作流程（以Clontech Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）

完整的Matchmarker篩選過程包含以下步驟：

*步：執行對照實驗；

第二步：誘餌載體的構建及自我激活和毒性檢測；

第三步：篩選Mate&Plate文庫

第四步：確認和闡釋結果

圖3. 使用Mate&Plate文庫進行雙雜交篩選。捕獲蛋白（bait protein）是酵母菌Y2HGold表達的Gal4 DNA-BD融合蛋白。高復雜性文庫表達Gal4 AD融合蛋白，由Y187酵母菌提供。當兩種轉化菌株混合過夜能接合產生二倍體（Diploids）。此二倍體含有4個報告基因：HIS3，ADE2，MEL1和AUR1-C，受雙雜交作用而活化表達。

酵母雙雜交檢測需要產品信息：

我司（懋康生物）提供酵母雙雜交研究需要的一系列產品，從酵母菌株、酵母質粒、酵母培養基到篩選標志（抗生素），咨詢，，：2971634497。

一、富集培養基（Rich Medium 酵母培養）

【補充描述】：

1. YPD是用于大多數酵母菌生長所需的酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖優化配比后組成的混合物；
2. YPDA培養基是在YPD基礎上添加硫酸腺嘌呤，終濃度120 µg/ml。

二、基本培養基（Minimal Medium 酵母培養）

【補充描述】：

1. SD Medium：酵母菌用的基本的合成限定培養基（Minimal synthetically defined medium），包含氮源，碳源（葡萄糖，除非有特殊說明）和DO添加劑（Dropout Supplement）。
2. DO（Dropout Supplement or Solution）：特定氨基酸和核苷的混合物，添加到SD base內以配制SD Medium。DO缺少一種或者更多未轉化酵母菌需要的營養成分使其在SD Medium上生長，作為營養篩選標志。

三、省卻成分氨基酸混合物（DO Supplements 酵母培養）

四、篩選抗生素（底物）

【補充描述】：

1）Aureobasidin A （AbA）金擔子素A是報告基因AUR1-C的篩選抗生素，以判斷酵母菌是否能表達賦予其AbA抗性的酶。

2）X-α-Gal是α-半乳糖苷酶（由MEL1基因編碼）的底物，當雙雜交發生時MEL1報告基因正常表達催化底物發生顏色反應，使得酵母菌落呈藍色。

3）X-Gal是ß-半乳糖苷酶（由lacz基因編碼）的底物。

五、酵母質粒提取試劑盒

【試劑盒工作原理】：

該試劑盒把硅膠柱純化技術同經典的SDS堿裂解法結合起來，用戶可在1小時內從酵母培養液中純化出高純度的質粒DNA。純化過程不需用任何到有害的有機物抽提，亦不需用到耗時的乙醇沉淀。質粒DNA的產量依賴于酵母攜帶質粒的拷貝數，酵母菌株以及生長條件。 一般來說，酵母質粒的拷貝數較低，5.0ml過夜培養液中質粒DNA產量約為1.0 µg左右。純化的質粒可直接用于酶切，PCR,電轉化等應用。酵母收集后,加入破壁酶和玻璃珠去除細胞壁,用傳統堿裂法裂解細胞，然后將獲得的上清液轉移至結合柱結合DNA，經過兩次快速洗滌，zui后用無菌水洗脫出質粒DNA。

六、酵母轉化試劑盒

【補充描述】：

酵母質粒轉化試劑盒，含PEG/liAC酵母轉化需要的所有試劑，操作簡單，轉化效率高。

七、酵母雙雜交菌和感受態細胞

八、酵母菌載體

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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