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      新聞動態
      抗(AbA)金擔子素A的酵母轉化操作方式
         (AbA)金擔子素A是從絲狀真菌Aureobasidiumpullulans No.R106中分離出來的環酯肽類抗生素,具有很強的抗真菌能力。 金擔子素A,Aureobasidin A(AbA)在較低的濃度下(0.1-0.5 μg/ml)即可對酵母產生毒性。對其敏感的真菌種類包括:出牙酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)和黑曲霉(A. niger.)。作用機制在于AbA抑制了真菌生長所依賴的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide,IPC)合成酶的活性,干擾鞘脂合成,從而進一步殺死菌株。編碼IPC合成酶的基因研究較多的有來自釀酒酵母菌的AUR1基因,以及構巢曲霉的AURA基因,兩者具有同源性。通過對這些編碼基因進行突變即可使得菌株對AbA產生抗性,如AUR1-C基因。

        (AbA)金擔子素A非常適合用作陽性克隆子篩選用的藥物選擇性標記。AbA抗性也是酵母單/雙雜交研究中理想的報告子。本品為溶于甲醇的AbA溶液,濃度為1 mg/ml。具體的工作濃度取決于宿主細胞的敏感度(見表1. AbA對各種酵母菌的低抑菌濃度(MIC))。

        (AbA)金擔子素A產品性質 產品描述冰袋運輸。4℃保存。

        (AbA)金擔子素A的操作步驟(抗(AbA)金擔子素A的酵母轉化系統)

        1) 加入0.5 ml過夜培養的酵母到50 ml YPD培養基中(配方:1L液體培養基含有10g yeast extract,20g polypeptone, 20g D-glucose;固體培養基另外加入2%瓊脂;)。

        2) 30℃培養約6小時,測定OD660為1~2。使用二倍體時,測定OD660為2~4。

        3) 1,000×g離心5分鐘。

        4) 用10 ml Solution A(配方:100 mM Lithium acetate,10 mMTris-HCl pH7.5,1 mM EDTA)懸浮沉淀,1,000×g離心5分鐘。

        5) 用Solution A重懸沉淀,直到OD660為150。

        6) 在管內分取100 μl細胞懸浮液,30℃培養1小時。

        7) 加入5μg載體(環狀或線性DNA)和150 μg Carrier DNA,100℃加熱10分鐘,迅速冷卻。

        注:pAUR101需使用線性DNA進行轉化。使用環狀DNA會降低轉化效率甚至轉化不成功。pAUR112和pAUR123需使用完整的質粒DNA進行轉化。

        8) 加入850 μl Solution B(配方:取40 g Polyethylene Glycol 4000溶于100 ml Solution A充分溶解,需要現用現配),輕輕混勻。

        9) 30℃培養30分鐘后,42℃培養15分鐘。

        10)室溫放置10分鐘。

        11)5,000 rpm離心1分鐘,用5 ml YPD培養基懸浮沉淀。

        12)30℃培養6小時~過夜。

        13)5,000~10,000 rpm離心,用1-10 ml 0.9% NaCl懸浮沉淀。

        14)在YPD選擇培養基平板(含有一定濃度的AbA,依菌株類型而定)上接種100μl細胞懸液。30℃培養3-4天后轉化完成。

        15)挑取陽性轉化子,和/或測定轉化效率(以每微克質粒DNA轉化的菌落數來表示)。

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